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Real-time PCR reaction의 대부분은 각각 20μl, 10μl 또는 5μl의 reaction volume을 가지고 실험합니다.

이것은 cDNA와 reaction volume을 비교하기 위해 필요한 모든 sample을 지속적으로 유지하는데 매우 중요합니다.

IDT는 각각의 sample을 위해 최소한의 triplication reaction을 추천합니다.

각각의 assay를 위해 reaction수를 셀 때, control sample 안에 있는 factor를 기억해야 합니다.

1. 멸균된 1.5ml tube와 pipette the assay, MasterMix 그리고 water 의 volume은 첨부된 표를 보시면 됩니다.

1. Tube를 닫고, 섞습니다. 그리고, 750Xg, 10초 동안 centrifuge에 돌립니다.

2. Reaction total volume과 수에 따라 96well Plate 또는 384well Plate를 선택할 수 있습니다.

3. Reaction Plate의 각각의 well에 적절한 MasterMix를 넣습니다. (either 20ul, 10ul or 5μl minus the cDNA volume)

4. cDNA를 well에 적절히 넣고, pipette을 이용하여 섞습니다.

5. Optical clear film으로 Plate를 sealing합니다.

6. 1000Xg, 30초 동안 centrifuge를 돌립니다. 그리고, PCR기기에 plate를 넣습니다.

7. Real-time PCR을 [95’C(3min-10min), 95’C(0.15s)-60’C(0.45s)] X 40cycle하는 것을 추천합니다.

그러나, 정확한 cycling parameter는 특별한 장비와 사용하고 있는 MasterMix에 의해 결정되어집니다.

정확한 Cycling condition을 위해 사용하고 있는 MasterMix의 instruction과 장비의 manufacture의 guideline을 참고하면 됩니다.

Activity한 효소를 위해 정확한 cycling condition을 사용하는 것은 실험의 성공을 위한 중요한 요소입니다.